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肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，简称S. pneumoniae），是一种革兰氏阳性细菌，寄居于人类上呼吸道黏膜表面，可引起多种疾病，包括肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症。其细胞壁外的多糖荚膜是关键的毒力因子。目前已有101种不同的肺炎链球菌荚膜多糖血清型被识别。由于对青霉素及其他抗生素的耐药性日益增强，世界卫生组织（WHO）在2017年将肺炎链球菌列为需要紧急研发新型抗生素的“重点病原体”之一，这凸显了开发新型疫苗策略以预防该病的重要性[1]。
肺炎链球菌多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗免疫原性评价，主要通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测血清中型特异性IgG抗体水平和多型调理吞噬杀菌实验（MOPA）评估功能性抗体。MOPA可以通过测量抗体促进吞噬细胞杀灭细菌的能力，更直接地反映免疫保护效果。
IgG抗体检测：ELISA方法
ELISA通过抗原-抗体特异性结合来检测血清中荚膜多糖特异性IgG的浓度。
基本步骤包括：将肺炎链球菌荚膜多糖抗原包被在微孔板上；加入待测血清，使特异性抗体与抗原结合；加入酶标记的二抗并与抗体结合；加入底物显色，颜色深度与抗体浓度成正比。
检测的是抗体总含量，结果通常以抗体浓度（如μg/mL） 或滴度表示。对于肺炎链球菌疫苗，特别是针对婴幼儿，国际上常采用0.35 μg/mL的IgG浓度作为疫苗有效性的血清学替代终点。
ELISA的主要局限在于无法区分具有保护作用的功能性抗体和无效抗体。有些人（如老年人和免疫系统不完善者）接种疫苗后可能产生大量抗体，但这些抗体无法有效介导吞噬细胞清除细菌，从而导致保护力评估偏差。
多重调理吞噬杀菌实验（MOPA）
MOPA模拟人体内抗体清除细菌的免疫过程，即调理吞噬作用。该过程需要特异性抗体、补体和吞噬细胞（如HL-60细胞）共同参与。功能性抗体识别并结合细菌后，补体进一步活化并沉积在细菌表面，吞噬细胞通过其表面的Fc受体和补体受体识别被"标记"的细菌，进而吞噬并杀伤细菌。MOPA通过定量分析血清促进吞噬细胞杀伤肺炎链球菌的能力，来评估功能性抗体的滴度。[2]
MOPA结果以调理吞噬杀菌滴度（OPATiter）表示，通常定义为能杀死50%细菌的血清最高稀释度的倒数。该方法能直接反映抗体的实际功能活性，其与疫苗临床有效性的相关性被认为高于ELISA。此外，多重MOPA可在一份血清样本中同时检测针对多种血清型肺炎链球菌的功能抗体，大大提升了效率。
IgG ELISA与MOPA的协同与应用
在疫苗的免疫原性评价中，IgGELISA和MOPA常协同使用，互为补充。
典型的评价流程常以ELISA进行初筛，快速评估免疫后抗体总体水平。随后对阳性样本或关键样本进行MOPA分析，确认其功能性抗体滴度，为疫苗保护效力提供更直接的证据。
多糖疫苗与结合疫苗：多糖疫苗（如PPV23）主要激发B细胞产生抗体，不依赖T细胞，评价时主要关注IgG水平和OPA活性。结合疫苗（如PCV13/15）将荚膜多糖与蛋白质载体（如CRM197）偶联，转化为T细胞依赖性抗原，能诱导更强的免疫应答和免疫记忆。评价时，除抗体水平和OPA活性外，还可关注免疫记忆的相关指标。
蛋白亚单位疫苗与mRNA疫苗：新型疫苗（如基于PspA、PsaA等保守蛋白的疫苗或mRNA疫苗）旨在克服血清型限制。其评价重点在于疫苗诱导的抗体是否具有广谱的交叉保护能力，此时MOPA在评估对不同血清型的杀菌效果方面尤为重要。
IgG 抗体检测的标准化与挑战
肺炎链球菌荚膜多糖特异性IgG抗体的定量检测，目前国际公认的标准方法是世界卫生组织（WHO）推荐的酶联免疫吸附试验（Pn PS ELISA）[3]。标准化的核心目的在于确保不同实验室、不同时间点的检测结果具有可比性和可靠性，这对于疫苗效力评价和流行病学研究至关重要。
尽管有标准化的流程，但在实际操作和应用层面，IgG抗体检测仍面临多重挑战：
抗原的复杂性与交叉反应：肺炎链球菌有90多种血清型。其荚膜多糖结构复杂，且不同血清型之间可能存在抗原表位交叉，这给型特异性IgG的精准定量带来困难。此外，如何有效去除血清中对C-多糖的非特异性抗体，仍是保证检测特异性的一个技术要点。
标准化实施的现实困难：WHO的标准化方案在实际推广中常遇阻力。例如，关键试剂（如标准品、特定多糖抗原）的获取可能受限且成本高昂。同时，操作流程复杂，对人员技术要求高，不同实验室在细节（如吸附条件、板间差异控制）上的细微差别都可能导致结果偏差，影响了实验室间的结果可比性。
MOPA实验的标准化与挑战
尽管MOPA价值显著，但其应用仍面临挑战，主要体现在实验的复杂性和标准化方面。
MOPA操作步骤繁琐，涉及HL-60细胞的培养与分化、细菌的培养与定量、补体的筛选等多个环节，对实验人员的技术要求高，且任何环节的波动都可能影响结果的稳定性。
为确保结果可靠，需对实验各环节进行严格质量控制，例如监控HL-60细胞的分化状态和活性，验证工作菌种的特性，以及筛选合适的补体。目前，国际上多个实验室和研究机构正致力于推动MOPA的标准化，例如参照美国阿拉巴马大学（UAB）的操作规范（UAB-MOPA）[4]。
总结与展望
IgG ELISA和MOPA是肺炎链球菌免疫原性体外评价体系中不可或缺的两种方法。ELISA擅长快速定量筛查抗体水平，而MOPA则用于精准评估抗体的实际保护功能。IgG ELISA和MOPA均操作流程复杂，对实验人员的技术要求均高，且任何环节的波动都可能影响结果的稳定性。
斯丹姆医药子公司安渡生物医药（杭州）有限公司（以下简称"安渡生物"）已建立了完善的肺炎疫苗免疫原性评价分析平台。配备专属实验场地，均有BSL-2备案。其中IgG ELISA专用实验室：面积120m2，配有TECAN全自动酶免工作站；MOPA实验专用实验室：细胞培养室 60m2、细菌操作室110m2，相关仪器设备配置齐全（如：生物安全柜、菌落计数仪、流式细胞仪、细胞计数仪等）。实验人员具有丰富的肺炎疫苗临床试验免疫原性评价分析经验，现已完成两种方法的建立与验证，可在短时间内完成样本分析，加速项目推进速度，助力企业肺炎疫苗研发。
参考文献
[1] Yanxia Wang,Zhiqiang Xie,Lili Huang,et al.Preliminary Evaluation of the Safety and Immunogenicity of a Novel Protein-Based Pneumococcal Vaccine in Healthy Adults Aged 18–49: A Phase Ia Randomized, Double Blind, Placebo-Controlled Clinical Study. Vaccines (Basel). 2024 Jul 23;12(8):827.
[2] Katrina M Nolan , Marie E Bonhomme, Christina J Schier,et al. Optimization and validation of a microcolony multiplexed opsonophagocytic killing assay for 15 pneumococcal serotypes. Bioanalysis. 2020 Jul;12(14):1003-1020.
[3] Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG (Pn PS ELISA). (007sp Version).
[4] Protocol for multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA) for antibodies against Streptococcus pneumoniae (Version E.02, December 2014).
更新后的指南草案涉重点关注临床试验设计、监管考虑，以及这些试验是否能够证明药物能够维持根据BMI确定的减肥效果。
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